Immuno Microenvironment, Adoptive and Vaccines Approaches

The Platform of Immuno-Microenvironment, Adoptive and Vaccine Approaches, coordinated by Marcella Tazzari Lab Researcher, is actively focused on the generation of innovative cellular therapies and their safe translation from the research laboratory to the clinic. Our mission is to support GMP factories to successfully overcome road blocks in the process of developing Advanced Therapy Medicinal Products (ATMPs). We work in close contact with our Clinicians to develop targeted immunotherapies and novel and combinatorial approaches with an emphasis on treating solid and haematological neoplasia through distinct therapeutic modalities: Dendritic Cell Vaccine, Adoptive cell therapy (ACT) with allogeneic genetically modified NK cells and ACT with autologous tumor infiltrating T Lymphocytes (TILs). Moreover, aiming at the development of immunotherapy strategy for the comprehensive tumor cell eradication, we are also assessing the feasibility of a novel cellular(radio)immunotherapy approach. As pre-GMP Facility we are mainly focused on:

• high-content analysis of GMP-manufactured ATMPs and infused patients for the fine-tuning of ATMPs in vivo clinical activity/specificity;
• transfer of research ideas into the preclinical development of novel ATMPs and implementation of the existing ones;
• transform research protocols into standardized operational procedures (SOPs) under GMP-like conditions (including the development of new gene and nanoparticles delivery tools and genetic modification of cells);
• develop SOPs and procedure that can be transferred to a GMP facility;
• perform validation runs that do not require GMP standards. Moreover, for ATMPs validation we relaied on in house in vitro assays (both in 2D and 3D) for testing activation, killing and homing capabilities.

For the success of immunotherapies in solid tumors, the tumor microenvironment (TME) is regarded as one of the biggest challenges. Through the past years we have been investing in the generation of three dimensional tumor models (particularly for melanoma) facing the complexity and immunocompetency of the real tumors [Di Blasio et al Nature Communications 2019] and in developing a multiplex immunohistochemistry approach [Bulgarelli et al Frontiers Immunology 2019] for a comprehensive analysis of the TME. Using these innovative systems our Team investigates:

• pathways linked to immunosuppression;
• tumor derived antigens recognized by T cells and heterogeneity of tumor cells in the context of an anti-tumor response;
• analyze the biological function exerted by ATMPs;
• seek out clinically relevant inhibitory and/or stimulatory signals for the design of the best combo strategies (such as the rational use of cellular therapies in conjunction with antibody delivery against the immune checkpoint inhibitors) and targeted therapeutic modulation of ATMP activities.

Staff: Marcella Tazzari (coordinatrice), Martine Bocchini, Nicola Romanini.

Clinical and experimental Immunomonitoring

Il Laboratorio di Immunomonitoraggio clinico e Sperimentale (CLEM) rappresenta un’importante piattaforma tecnologica dell’Istituto per il monitoraggio di pazienti oncologici in trattamento con terapie immunologiche avanzate e farmaci in sperimentazione clinica, svolgendo una delle attività cardine della ricerca traslazionale mission dell'Istituto.

Più nel dettaglio, all’interno del nostro Istituto presso l’Immuno-Gene Therapy Factory (IGTF) vengono prodotti farmaci sperimentali in accordo con linee guida sulle norme di buona
fabbricazione (GMP) per la cura di pazienti oncologici affetti da tumori solidi che interessano diversi distretti anatomici.

Il monitoraggio immunologico viene eseguito su campioni biologici collezionati durante precisi time point della terapia anti-tumorale dal Centro Risorse Biologiche (CRB) e si avvale di tecnologie sinergiche che permettono di valutare nell’insieme le risposte immunologiche circolanti e tissutali e i meccanismi di resistenza tumorali.

Le attività di ricerca traslazionale del nostro laboratorio e la stretta collaborazione con i team clinici e gli altri gruppi di ricerca sono fondamentali e necessarie per trasferire i risultati ottenuti dal laboratorio al letto del paziente, innovare i prodotti cellulari farmaceutici già esistenti e sviluppare nuove ed efficaci terapie avanzate (ATMPs) e combinazioni terapeutiche. Le analisi e le strumentazioni principalmente applicate sono:

• test per la caratterizzazione del profilo di risposta immunologica tumore-specifica (ELISpot test, INFγ Secretion assay e test dei tetrameri);
• analisi citofluorimetrica multiparametrica e sorting per la caratterizzazione delle popolazioni immunitarie circolanti (Principali strumenti utilizzati: FACS Attune Next, FACS Canto, BD Sorter Melody);
• ricerca di proteine/biomarcatori circolanti attraverso saggi automatizzati ad alta specificità (ELISA, test immunologici per ricerca contemporanea di più analiti automatizzato su piattaforma ELLA);
• analisi di immunoistochimica classica e sequenziale per il monitoraggio della risposta immune al sito tumorale (Ventana BenchMark, Aperio CS2 scanner);
• analisi tramite sequenziamento di nuova generazione (NGS) del recettore dei linfociti T (TCR sequencing), dell’intero trascrittoma tumorale (RNA Sequencing) o delle cellule
  immunitarie per la valutazione del profilo trascrizionale specifico (analisi single cell) e dell’intero genoma (Whole Exome Sequencing) per l’identificazione di specifiche mutazioni
  che potenzialmente conferiscono resistenza all’immunoterapia.

Le collaborazioni aperte con ricercatori e gruppi di ricerca esterni all’Istituto spaziano sia in ambito nazionale che internazionale. Quali ad esempio:

• Dipartimento di Genomica Funzionale e Cancro dell'IGBMC, (Illkirch, Francia);
• Laboratorio di Dermatologia Sperimentale, Centro Medico Accademico, Università di Amsterdam, Paesi Bassi;
• Dipartimento per la terapia cellulare, Ospedale universitario di Oslo, Norvegia;
• Dipartimento di scienze mediche materne e chirurgiche, Università di Modena e Reggio Emilia, Modena, Italia.

Staff: Jenny Bulgarelli, PhD (coordinatrice), Dalila Fanelli, Giada Sabatino

The CLinical and Experimental ImmunoMonitoring Laboratory (CLEM) is a significant technological platform within the Immunotherapy Research hub in the Institute. It exerts its activity for the
immunological monitoring of cancer patients, being treated with immunological therapies and drugs in clinical trials. In detail, according to Good Manufacturing Practice (GMP) guidelines, the Immuno-Gene Therapy Factory (IGTF) of the Institute, produces experimental drugs for treating oncological cases characterized by solid tumours which involve different anatomical districts.

The immunological monitoring is performed on biological samples collected at precise time points during the anti-cancer treatment by the Biological Resource Centre (BRC), and comprises
synergistic technologies used for the overall assessment of circulating and tissue immunological response or resistance mechanisms.

The translational research activities that characterized our laboratory, together with the close collaboration with the clinical team and other research groups, are fundamental for transferring
the results obtained from the laboratory to the patient bedside, for the innovation of existing cellular pharmaceutical products, and for the development of new and effective advanced
therapies (ATMPs) together with the generation of novel drug combinations.

The analyses and tools mainly applied are listed here:

• tests for characterisation of the tumour-specific immunological response profile (ELISpot assay, INFγ Secretion assay, and tetramer assay);
• multi-parametric cytofluorimetric analysis and sorting for the characterisation of circulating immune populations (Main instruments used: FACS Attune Next, FACS Canto, Sorter Melody)
• detection of circulating proteins/biomarkers utilizing highly specific automated assays (ELISA, immunoassays for simultaneous detection of several analytes, this is automated on the ELLA platform);
• classical and sequential immunohistochemistry analysis for monitoring the immune response at the tumour site (Ventana BenchMark, Aperio CS2 scanner);
• NGS (next-generation sequencing) analyses. This methodology concerns the study of the T- lymphocyte receptor (TCR sequencing), the entire tumour transcriptome (RNA
  sequencing), or immune cells for the evaluation of the specific transcriptional profile (single cell analysis) and the whole genome (Whole Exome Sequencing) for identification of specific mutations which can potentially confer resistance to the immunotherapy treatment.

The close collaborations established with researchers and groups outside the Institute cover a range from national to global. The following are some of the collaborations:

• Department of Functional Genomics and Cancer at the IGBMC, (Illkirch, France);
• Laboratory of Experimental Dermatology, Academic Medical Centre, University of Amsterdam, The Netherlands;ù
• Department of Cell Therapy, Oslo University Hospital, Norway;
• Department of Maternal and Surgical Medical Sciences, University of Modena and Reggio Emilia, Modena, Italy

Main funded projects that support our research:

1. PEGASO: Nanotechnology-based Platforms for the improvEment of therapeutic strateGies in soft tissue sArcoma and melanoma leSiOns (Finalized Research-Young Researchers GR-2021-12372877)
2. HUB LIFE SCIENCE - ADVANCED THERAPY (LSH-TA) (PNC-E3-2022-23683269). Funded by the Ministry of Health under the National Plan for Investments Complementary to the National Plan for Recovery and Resilience, “Innovative Health Ecosystem” program.
3. Current Research funded by the Ministry of Health

Staff: Jenny Bulgarelli, PhD (Coordinator), Dalila Fanelli, Giada Sabatino.

Adoptive CAR T Cell Platform

Il nostro gruppo di ricerca denominato Adoptive Cell Therapy CAR T platform si occupa di diverse tematiche nell’ambito dell’oncologia e delle malattie infettive. In particolare il focus della nostra attività di ricerca è quello della comprensione, caratterizzazione e sfruttamento della risposta del sistema immunitario al fine di controllare e combattere le neoplasie umane e le malattie infettive quali il COVID-19, ambito che potremmo definire come immunologia molecolare. Per far questo in maniera esaustiva e dettagliata ci avvaliamo sia di tecnologie innovative come il next generation sequencing (NGS) sia di approcci di ingegneria genetica per modificare le proprietà delle cellule a fini di studio e a scopo terapeutico. In tal senso stiamo sviluppando nuovi chimeric antigen receptors (CARs) che è possibile trasferire nelle cellule dei pazienti per modificare il tropismo e la capacità di risposta del paziente contro la propria malattia. Le patologie di cui ci stiamo occupando sono in particolare il melanoma, il mesotelioma pleurico, la leucemia linfoblastica di tipo T e il tumore al polmone non a piccole cellule. Per questi tumori stiamo identificando nuovi antigeni e anticorpi in grado di bersagliarli per creare immunoterapie più efficaci e di ultima generazione. Siamo inoltre interessati ad identificare marcatori predittivi e diagnostici nell’ambito del mesotelioma pleurico e del tumore neuroendocrino del pancreas per cui abbiamo programmi di studio e terapeutici in corso. Questa attività ci consentirà in futuro di anticipare la diagnosi di questi pazienti così migliorandone il trattamento e l’aspettativa e probabilità di sopravvivenza che oggi è decisamente bassa. Abbiamo anche diversi progetti di studio riguardanti l’infezione COVID-19. In questo ambito in particolare stiamo partecipando a importanti progetti a livello nazionale ed internazionale che mirano a:

1. comprendere l’impatto dell’esposizione al SARS-CoV-2 e ai vaccini per il COVID-19 sul sistema immunitario umano;
2. capire come sfruttare questa risposta immunitaria a nostro favore contro il virus;
3. individuare farmaci che contrastino con la progressione severa del COVID-19 nei pazienti, infezione che impatta specialmente in individui già affetti da altre patologie, in particolare quelle oncologiche;
4. sviluppare una terapia molecolare che non miri al contrasto del virus ma alla protezione delle cellule umane dall’ingresso dei Coronavirus.

Strumentazioni

Le strumentazioni principalmente utilizzate dal gruppo di ricerca sono costituite da macchinari che utilizzano metodologie di sequenziamento di nuova generazione (NGS; MiSeq, NextSeq500, NovaSeq6000) e che ci consentono di effettuare la caratterizzazione del repertorio recettoriale dei linfociti T e B in pazienti e in individui esposti ad infezione o terapie. Per valutare i profili di espressione genica sia in cellule tumorali sia in cellule del sistema immunitario ci avvaliamo di tecnologie quali Nanostring e Real-Time PCR, per comprendere come il comportamento di entrambe si modifichi a seconda dell’individuo, del tipo di malattia e del trattamento. Per la caratterizzazione delle cellule a livello di marcatori di superficie utilizziamo citometri a flusso quali Attune Next (Thermo) e FACS Melody (BD) mentre per la caratterizzazione e quantifica delle citochine presenti nel sangue dei pazienti o prodotte dalle cellule mantenute in coltura usiamo il sistema ELLA (Protein Simple). Utilizziamo inoltre la piattaforma semiautomatica VENTANA (Roche) per la validazione del legame degli anticorpi ai tessuti umani per IHC. Per quanto riguarda la nostra ricerca di nuovi anticorpi allo scopo di bersagliare i tumori utilizziamo tecnologie quali il phage display per la selezione dei candidati e il sistema NGC Quest (BioRad) per la purifica di anticorpi e proteine ricombinanti per cromatografia. Utilizziamo inoltre sistemi di produzione in batch per la generazione di particelle lentivirali atte alla ingegnerizzazione genetica delle cellule del sistema immunitario (es. CAR T) e sistemi di elettroporazione per protocolli di ingegnerizzazione non-virale (es. 4D Lonza; Electroporator Miltenyi). Per la produzione di cellule geneticamente ingegnerizzate e il set up di processo in Pre-GMP utilizziamo il sistema chiuso CliniMACS Prodigy (Miltenyi). Ci avvaliamo anche dell’infrastruttura interna del Centro Risorse Biologiche (CRB), la biobanca di tessuti di IRST, che raccoglie i campioni donati a scopo di ricerca dai pazienti oncologici dopo firma di un consenso informato dedicato.

Staff: Massimiliano Mazza (coordinatore), Patricia Borges de Souza, Anna De Lucia, Anna Gaimari, Lucia Mazzotti, Fabio Nicolini, Luigi Pasini, Matteo Zurlo.